生物實驗室利用hth体会官方网页版進行大鼠肝S9的製備和蛋白
時間:2019-07-09 10:17來源: 作者:ydgmve2020yyx 點擊:
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1 實驗目的 學會大鼠肝S9的製備及其蛋白含量的測定。 2 實驗材料與方法 2.1實驗動物 大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 齡，150g左右 2.2試劑 1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥鈉、戊
1 實驗目的
學會大鼠肝S9的製備及其蛋白含量的測定。
2 實驗材料與方法
2.1實驗動物
大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 齡，150g左右
2.2試劑
1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、多氯聯苯、β-萘黃酮
Tris-HCl緩衝液：6.05g Tris加約800ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml
2.3器材
低溫高速離心機、潔淨工作台、勻漿器、注射器、手術剪、低溫冰箱、MVEhth体会官方网页版等
2.4 實驗操作
2.4.1試劑的配製
（1）Tris-HCl緩衝液：6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml
（2）考馬斯亮蘭G-250染料：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶於50ml 95％的乙醇後，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
2.4.2肝S9的製備
（1）誘導 苯巴比妥鈉80mg/kg， 腹腔注射，連續3～5d，最後一次給藥後24h後采樣。
（2）采樣 采樣前禁食24h，但可以自由飲水；斷頭處死；無菌取出肝髒，置平皿中稱重，用預冷的0.15M KCl溶液淋洗數次，以便除去能抑製微粒體酶活性的血紅蛋白。
（3）肝勻漿的製備 棄去淋洗液，將肝髒轉入小燒杯，加 Tris-HCl緩衝液溶液 3mL/g （肝濕重），轉入冰浴，用剪刀剪碎肝髒，轉入勻漿器勻漿。
（4）製備S9 將肝勻漿於低溫高速離心機0～4℃ 000g 離心 10min上清液即為S9。
（5）分裝保存 將製備好的S9於無菌冷凍管或安瓿中保存，每個安瓿2mL左右。於MVEhth体会官方网页版速凍後置-80℃低溫保存。深低溫或冰凍幹燥，保存期不超過一年。
2.5蛋白含量測定（考馬斯亮蘭染色法）
2.5.1測定原理
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質（主要是堿性氨基酸，特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基）結合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。染料在595nm下測定的吸光度值與蛋白質濃度成正比。
2.5.2特點
（1）靈敏度高，比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達0.5 mg
（2）測定快速、簡便，隻需加一種試劑。完成一個樣品的測定，隻需要5分鍾左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約隻要2分鍾即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鍾至20分鍾之間，顏色的穩定性最好。
（3）幹擾物質少。如幹擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩衝液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不幹擾此測定法。
2.5.3試劑與器材
試劑：
標準蛋白質溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）
考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶於50ml 95％的乙醇後，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
Tris-HCl緩衝液： 6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml（0.05M）
2.5.4操作方法
微量法製定標準曲線
按下表加樣，混勻，室溫靜置5-10min，以0號試管為空白對照，於595nm處比色測定吸光度，平行測定三次。95nm處吸光度為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪製標準曲線。
表一：測定標準曲線的試樣
樣品編號 0 1 2 3 4 5 6
標準血清溶液（ug）
標準血清溶液（ml）
蒸餾水（ml） 0
0
0.1 10
0.01
0.09 20
0.02
0.08 40
0.04
0.06 60
0.06
0.04 80
0.08
0.02 90
0.1
0
考馬斯亮蘭試劑（ml） 5.0
肝S9蛋白質濃度的測定
測定方法同上，分別取肝S9組分10倍稀釋液20mL、30mL、40mL，按下表加樣，測595nm的吸光度值，平行測定三次。根據所測定的平均值，在標準曲線上查出其相當於標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
表二：待測蛋白的試樣
樣品編號 0 1 2 3
上清液（ml）
蒸餾水（ml） 0
0.1 0.02
0.08 0.03
0.07 0.04
0.06
考馬斯亮蘭試劑（ml） 5.0
3 實驗結果
表三：準曲線管的吸光度值
試樣 1 2 3 4 5 6
一 0.012 0.087 0.209 0.330 0.465 0.630
二 0.062 0.084 0.245 0.360 0.472 0.600
三 0.085 0.100 0.258 0.380 0.445 0.620
平均值 0.053 0.090 0.237 0.357 0.461 0.617
圖一：蛋白質濃度和吸光度的標準曲線圖
表四： 稀釋液樣品吸光度值
試樣 1 2 3
一 0.255 0.439 0.520
二 0.208 0.280 0.466
三 0.195 0.435 0.690
平均值 0.220 0.385 0.559
利用軟件讀出稀釋液樣品的蛋白分別為0.038、0.066、0.095。
算出三次取樣的上清液濃度分別為19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml，取平均值得蛋白質的濃度為21.7 mg/ml。
4討論
肝髒微粒體中含有多種酶係統,是許多藥物、殺蟲劑、除草劑、汙染物及食物添加劑等外源性高脂溶性物質在體內的主要生物轉化場所,也稱為肝微粒體藥物代謝酶,簡稱為肝藥酶。該酶係統底物麵廣,活性個體差異大,影響活性因素多。其中最重要的是混合功能氧化酶係統,可催化許多不同型的氧化反應,如羥基化,烷基化,脫氨基化,脫鹵素,硫原子氧化等。該酶係統中一個主要成分是細胞色素P450,是由與一氧化碳結合後,在光譜450nm處有吸收峰而得名。細胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶係統活性的高低,這個係統將分子氧中一個氧原子氧化藥物,另一個氧原子生成水,沒有產生相應的還原物,故也稱為細胞色素單加氧酶。肝S9主要存在於肝細胞內質網中，是一個酶係統。
肝微粒體酶的製備需在無菌條件下操作，製備之後要用液氮速凍後置-80℃低溫保存。凍幹法是生物化學、生物製劑和微生學用以保持某些蛋白質、酶類和原核生物活性的較好方法之一。保持肝的代謝活性, 實質上就是要保持肝內微粒體膜上的酶類的活性。因此, 用凍幹法保持肝的代謝活性。本次實驗過程肝S9製備好以後直接用於測定因此沒有進行凍幹儲存的步驟。
學會大鼠肝S9的製備及其蛋白含量的測定。
2 實驗材料與方法
2.1實驗動物
大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 齡，150g左右
2.2試劑
1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、多氯聯苯、β-萘黃酮
Tris-HCl緩衝液：6.05g Tris加約800ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml
2.3器材
低溫高速離心機、潔淨工作台、勻漿器、注射器、手術剪、低溫冰箱、MVEhth体会官方网页版等
2.4 實驗操作
2.4.1試劑的配製
（1）Tris-HCl緩衝液：6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml
（2）考馬斯亮蘭G-250染料：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶於50ml 95％的乙醇後，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
2.4.2肝S9的製備
（1）誘導 苯巴比妥鈉80mg/kg， 腹腔注射，連續3～5d，最後一次給藥後24h後采樣。
（2）采樣 采樣前禁食24h，但可以自由飲水；斷頭處死；無菌取出肝髒，置平皿中稱重，用預冷的0.15M KCl溶液淋洗數次，以便除去能抑製微粒體酶活性的血紅蛋白。
（3）肝勻漿的製備 棄去淋洗液，將肝髒轉入小燒杯，加 Tris-HCl緩衝液溶液 3mL/g （肝濕重），轉入冰浴，用剪刀剪碎肝髒，轉入勻漿器勻漿。
（4）製備S9 將肝勻漿於低溫高速離心機0～4℃ 000g 離心 10min上清液即為S9。
（5）分裝保存 將製備好的S9於無菌冷凍管或安瓿中保存，每個安瓿2mL左右。於MVEhth体会官方网页版速凍後置-80℃低溫保存。深低溫或冰凍幹燥，保存期不超過一年。
2.5蛋白含量測定（考馬斯亮蘭染色法）
2.5.1測定原理
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質（主要是堿性氨基酸，特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基）結合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。染料在595nm下測定的吸光度值與蛋白質濃度成正比。
2.5.2特點
（1）靈敏度高，比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達0.5 mg
（2）測定快速、簡便，隻需加一種試劑。完成一個樣品的測定，隻需要5分鍾左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約隻要2分鍾即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鍾至20分鍾之間，顏色的穩定性最好。
（3）幹擾物質少。如幹擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩衝液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不幹擾此測定法。
2.5.3試劑與器材
試劑：
標準蛋白質溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）
考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶於50ml 95％的乙醇後，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
Tris-HCl緩衝液： 6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，最後用蒸餾水定容至1000ml（0.05M）
2.5.4操作方法
微量法製定標準曲線
按下表加樣，混勻，室溫靜置5-10min，以0號試管為空白對照，於595nm處比色測定吸光度，平行測定三次。95nm處吸光度為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪製標準曲線。
表一：測定標準曲線的試樣
樣品編號 0 1 2 3 4 5 6
標準血清溶液（ug）
標準血清溶液（ml）
蒸餾水（ml） 0
0
0.1 10
0.01
0.09 20
0.02
0.08 40
0.04
0.06 60
0.06
0.04 80
0.08
0.02 90
0.1
0
考馬斯亮蘭試劑（ml） 5.0
肝S9蛋白質濃度的測定
測定方法同上，分別取肝S9組分10倍稀釋液20mL、30mL、40mL，按下表加樣，測595nm的吸光度值，平行測定三次。根據所測定的平均值，在標準曲線上查出其相當於標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
表二：待測蛋白的試樣
樣品編號 0 1 2 3
上清液（ml）
蒸餾水（ml） 0
0.1 0.02
0.08 0.03
0.07 0.04
0.06
考馬斯亮蘭試劑（ml） 5.0
3 實驗結果
表三：準曲線管的吸光度值
試樣 1 2 3 4 5 6
一 0.012 0.087 0.209 0.330 0.465 0.630
二 0.062 0.084 0.245 0.360 0.472 0.600
三 0.085 0.100 0.258 0.380 0.445 0.620
平均值 0.053 0.090 0.237 0.357 0.461 0.617
圖一：蛋白質濃度和吸光度的標準曲線圖
表四： 稀釋液樣品吸光度值
試樣 1 2 3
一 0.255 0.439 0.520
二 0.208 0.280 0.466
三 0.195 0.435 0.690
平均值 0.220 0.385 0.559
利用軟件讀出稀釋液樣品的蛋白分別為0.038、0.066、0.095。
算出三次取樣的上清液濃度分別為19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml，取平均值得蛋白質的濃度為21.7 mg/ml。
4討論
肝髒微粒體中含有多種酶係統,是許多藥物、殺蟲劑、除草劑、汙染物及食物添加劑等外源性高脂溶性物質在體內的主要生物轉化場所,也稱為肝微粒體藥物代謝酶,簡稱為肝藥酶。該酶係統底物麵廣,活性個體差異大,影響活性因素多。其中最重要的是混合功能氧化酶係統,可催化許多不同型的氧化反應,如羥基化,烷基化,脫氨基化,脫鹵素,硫原子氧化等。該酶係統中一個主要成分是細胞色素P450,是由與一氧化碳結合後,在光譜450nm處有吸收峰而得名。細胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶係統活性的高低,這個係統將分子氧中一個氧原子氧化藥物,另一個氧原子生成水,沒有產生相應的還原物,故也稱為細胞色素單加氧酶。肝S9主要存在於肝細胞內質網中，是一個酶係統。
肝微粒體酶的製備需在無菌條件下操作，製備之後要用液氮速凍後置-80℃低溫保存。凍幹法是生物化學、生物製劑和微生學用以保持某些蛋白質、酶類和原核生物活性的較好方法之一。保持肝的代謝活性, 實質上就是要保持肝內微粒體膜上的酶類的活性。因此, 用凍幹法保持肝的代謝活性。本次實驗過程肝S9製備好以後直接用於測定因此沒有進行凍幹儲存的步驟。
