液氮保存胚胎腦組織與移植的實驗研究

　　一、實驗方法

　　正常妊娠15～21天的SD大鼠經戊巴比妥鈉麻醉後，在無菌條件下剖腹取胎，切取所需胎腦組織，製成1mm大小的組織塊。用吸管將其移入含10%二甲基亞(ya) 碸(DMSO)的無血清DMEM培養(yang) 液中，裝進凍存管，於(yu) 4℃平衡1小時後置入-30℃冰箱。約1小時後標本溫度降至-30℃(降溫速率為(wei) 0.5℃～1.0℃/分)，然後放入液氮中保存。需要時，取出凍存管於(yu) 37℃水浴中複溫，冰塊熔化後再用Hank液以1∶1比例對凍存液反複稀釋4次，每次3分鍾。此時即可用於(yu) 檢測和移植。細胞存活率檢測先采用胰酶消化製成細胞懸液，用0.4%台盼藍染色1分鍾，再按血球計數方法對死活細胞分別計數，求出細胞存活率。腦內(nei) 組織移植分A、B兩(liang) 組進行，每組12隻，分別進行新鮮組織移植和保存組織移植。兩(liang) 種組織均取自胎鼠頂葉，前者離開母體(ti) 時間不超過20分鍾，後者在液氮中保存30天。采用左頂葉皮層切開移植，每次植入3～5塊組織。飼養(yang) 6～8周後處殺，取腦，連續石蠟切片，進行HE、Nissl和嗜銀染色。

　　二、結果

　　細胞存活率觀察：不同部位組織在液氮中保存10天和30天，細胞存活率(%)大腦組織為(wei) 67.78±4.46和65.14±4.55，小腦組織為(wei) 68.93±5.67，腦幹組織為(wei) 71.07±7.43和69.63±1.99。經方差分析，三種組織之間細胞存活率差別不顯著(P>0.05)，不同保存時間之間細胞存活率差別也不顯著(P>0.05)。

　　腦內(nei) 移植組織學觀察：A組移植物成活例數7/12，移植物位於(yu) 皮層下或伸入側(ce) 腦室，體(ti) 積較大，周邊有薄層膠質細胞反應帶。移植物內(nei) 是均勻分布的大型神經元和少量散在的膠質細胞。神經元核大，染色淡，核仁清楚，並可見到雙核仁細胞，胞漿中尼氏小體(ti) 豐(feng) 富。移植物內(nei) 有新生血管結構及比較致密的神經纖維網，在交界麵上也有少量神經纖維。B組移植物成活例數2/10(2例感染不計)，移植物位於(yu) 皮層下，體(ti) 積小，呈散在的細胞團樣，神經元核大淡染，胞漿不豐(feng) 富。移植物內(nei) 也可見到血管內(nei) 皮細胞，嗜銀染色見移植物中神經纖維稀少。

　　三、討論

　　本實驗考察了兩(liang) 步法梯度降溫液氮保存胎腦組織的可能性。此法保存大鼠胎腦組織10天和30天平均細胞存活率在60%～70%。將新鮮的和保存30天的組織植入同種大鼠腦內(nei) ，組織學檢查發現兩(liang) 組都有移植物成活，但是與(yu) 新鮮組織移植相比，保存的組織移植後移植物體(ti) 積小，神經元數量少，胞漿不豐(feng) 富，移植物內(nei) 神經纖維少見，表明神經元分化較差。結果提示，用兩(liang) 步法梯度降溫液氮保存胎腦組織可取得較高的細胞存活率，移植後也有一定的成活率，但是移植物成活質量明顯不如新鮮組織移植。所以，這種保存方法能否實際應用還值得討論和進一步研究。查特hth体会官方网页版